Sequenciar o DNA significa delinear a ordem das bases nitrogenadas presentes nos genes.
Antes de tudo, as longas seqüências de DNA são picotadas em pedaços menores para que elas possam ser analisadas. Essa divisão do DNA é feita por enzimas especiais (enzimas de restrição). Alguns desses métodos permitem apenas que os cromossomos sejam cortados individualmente, outros conseguem cortar o genoma inteiro de uma vez.
Clonagem
Os fragmentos de DNA são então colocados em uma solução com bactérias. As bactérias multiplicam o DNA para que os cientistas possam ter mais matéria prima para análise. Essa etapa pode ser realizada também utilizando-se a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):
· Uma desnaturação no DNA, utilizando-se uma temperatura média de 92°C, na qual provocamos o rompimento das pontes de hidrogênio, e a conseqüente separação da cadeia dupla do DNA;
· Após a abertura, uma seqüência de bases iniciadora ou primer que foi introduzida na reação de PCR se liga de forma complementar na extremidade da fita de DNA. Sem esse artifício a enzima responsável pela replicação, chamada Taq polimerase, não consegue iniciar seu trabalho de formação da cadeia complementar do DNA.
· Dentre as bases que serão usadas na replicação do DNA, há algumas especiais chamadas terminadoras, que têm a propriedade de interromper a ação da enzima de replicação.
Marcação com fluorescência
Os fragmentos de DNA clonados são então divididos em quatro soluções. Cada uma das soluções contém substâncias florescentes que reconhecem os fragmentos de DNA que terminam com uma determinada letra (A, T, C ou G). Quando a letra é encontrada, o fragmento recebe uma espécie de "etiqueta" fluorescente para que possa ser reconhecido.
Separação
Os fragmentos de DNA "etiquetados" são então ligados a tubos finos cheios de gel. Uma carga elétrica lentamente "puxa" os pedaços de DNA para dentro dos tubos. Os pequenos fragmentos viajam mais rapidamente do que os grandes O processo acaba separando os fragmentos de acordo com o tamanho (eletroforese).
Leitura
Finalmente, todos os fragmentos são separados de acordo com o tamanho. Cada fragmento que é colocado na ordem é um par (A-T ou C-G) maior do que o fragmento seguinte. As "etiquetas" fluorescentes no fim de cada fragmento podem então ser lidas por um sistema a laser, que fornece em seguida a seqüência genética daquele pedaço de DNA.
ESQUEMA SIMPLES DO SEQUENCIAMENTO DE UM FRAGMENTO DE DNA
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